《实用免疫细胞与核酸》 二、关于探针的标记

（一）cRNA探针的同位素标记

1．标记液（转录标记）

2．转录缓冲液

※：用地高辛或生物素标记时，用UTP替代。

3．标记终止液

4．标记探针水解液

先用dH2O悬浮探针，再加入后两种试剂，轻轻振摇混合，于60℃条件下反应。

5．探针水解时间

注：LO－探针初始长度（kb）

Lf－探针的终长度（kb）

K－0.11kb/min

6．探针水解终止液

每次加入充分混合，临用前配。

7．探针沉淀液

每次加入，充分混合，新鲜配制。

（二）寡聚核苷酸3’端标记（cRNA探针）

1．标记反应液

2．终止液：0.2mol/L EDTA

3.探针沉淀液

（三）cRNA探针非同位素标记（地高辛及生物素）

1．标记液

△：生物素标记时为10mmol/L的生物素-11-UTP

※：为检测标记率而加。

2．转录标记终止液

（1）0.2mol/L EDTA：用于地高辛标记法

（2）生物素标记终止液：

（四）DNA探针标记常用试剂的配制

（1）10 ×缺口平移缓冲液：200mmol/l Tris-HCl,pH7.4含50mmol/L MgCl2;100mmol/Lβ-巯基乙醇、1mg/ml BSA。

（2）缺口平移反应终止液：200mmol/L NaCl;10mmol/l Tris-HCl,pH7.4;11mmol/L EDTA; 0.5% SDS。

（3）DNaseⅠ:干粉状DNaseⅠ(2000～3000u/mg)溶于20mmol/l Tris-HCl, pH7.5中（1mg/ml）,10μl分装，-20℃保存一年。

（4）10×DNA聚合酶Ⅰ（Klenow片段）缓冲液：500mmol/l Tris-HCl,pH6.6;100mmol/L Mg－Cl2;10mmol/L DTT;0.5mgBSA。

（5）10×激酶缓冲液：500mmol/L Tris-HCl,pH7.4,50mmol/L MgCl2;20mmol/LDTT; 1.0mmol/L亚精胺。

（6）10×随机引物标记缓冲液；500mmol/l Tris-HCl,pH6.6;100mmol/L MgCl2;10mmol/Lβ-巯基乙醇；500μg/ml BSA。

（7）1×加尾缓冲液：100mmol/L二甲胂化钾，pH7.0,1mmol/l CoCl20.2mmol/L DTT。

（8）1mol/L MgCl2:MgCl247.60g溶于500ml水中，100ml分装，高压灭菌，室温保存。

（9）0.25mol/L EDTA(Ph8.0):EDTA 52.02g溶于400ml水中，调pH至8.0，加水至500ml，100ml分装，高压灭菌，室温保存。

（10）4mol/L醋酸钠：取无水醋酸钠82g溶于200ml水中，用醋酸调pH至6.5，加水至250ml，高压灭菌，或0.45μm膜过滤，室温保存。

（11）10% SDS：10g SDS（十二烷基硫酸钠）溶于50ml水中，加水至100ml，分装后室温保存。

（12）20×SSC：取NaCl 175.3g;柠檬酸钠88.2g;加水至1000ml，用10mol/l NaOH调pH至7.0；高压灭菌，室温保存。

（13）无菌水：100ml去离子水或双蒸水，分装，高压灭菌，室温保存，开瓶后仅限一周使用。

（14）10×激酶缓冲液：500mmol/L Tris-HCl,pH7.4;100mmol/L MgCl2;50mmol/lDTT;10mmol/L亚精胺（非必需）。

（15）T4多聚核苷酸激酶：10u/μl，保存在甘油中，-20℃。

（16）TE缓冲液（Tris/EDTA）：Tris,10mmol/l pH7.4(0.5ml 2mol/L贮存液)，1.0mmol/l ED－TA,pH8.0(20μl 0.5mol/L)贮存液，加水至100ml，室温保存。

（17）2mol/L Tris-HCl pH7.4:Tris242.2g溶于850ml，加浓HCl 75ml ,边加边缓慢搅动，至pH7.4,于加水至1000ml。

（18）1mol/L DTT(二硫苏糖醇)：3.0g DTT溶于20ml水中，分装，于-20℃贮存。

（19）0.5mol/L EDTA（乙二胺四乙酸二钠盐）：在烧杯中先加入300ml水，加入93.5g EDTA－Na2·2H2O,充分混匀，加10mol/l NaOH调pH至8.0,加水至500ml。

（20）10mol/L NaOH：200g NaOH溶于450ml水中，混匀，再加水至500ml。

（21）5mol/L NaCl：292.25g NaCl,加水至1000ml。

（22）1mol/L HCl：加86.2ml浓盐酸至913.8ml水中。

（23）1mol/L CaCl2：147g CaCl2：2H2O,溶于1000ml水中,高压灭菌,室温保存。