《实用免疫细胞与核酸》 二、研究方法

1．组织切片中T淋巴细胞80年代以前多用玫瑰花瓣试验和酸性酯酶方法进行组织切片中T淋巴细胞研究，特异性较差。近年来多用OKT，Leu或CD等系列T淋巴细胞单克隆抗体进行研究，特异性高，可以分类出各种亚群。免疫组化染色中应注意以下几个方面：

（1）抗体的选择：根据不同目的选择相应的抗体，如要对人胃肠道组织进行研究，可选用OKT系统单抗；对鼠类等进行研究可选用Leu 或Thy系列。如要研究辅助性T淋巴细胞可用OKT4或CD4；研究抑制性T淋巴细胞可用OKT8或CD8等单克隆抗体。

（2）组织加工方法选择：目前所研究的特异性T淋巴细胞抗原决定簇多位于细胞膜上，用陈旧或普通组织固定和加工方法可能使抗原破坏，应采用新鲜组织和低温处理。具体方法是：手术或活检获得的组织立即用液氮冷冻，或用OCT复合物包埋后再放入液氮中，便于切片，Cryostat冰冻切片后室温下风干，用4℃纯乙醇或丙酮固定10min，PBS冲洗后即可进行免疫细胞化学染色。

（3）染色方法的选择：因抗原较微量，而且位于细胞膜，应采取敏感性强、特异性高、非特异性着色少的方法。虽然有报道采用间接荧光或间接酶标技术也能显示特异性T淋巴细胞，我们推荐最好采用PAP或ABC染色技术。具体方法参阅第三，四章　。

2．粘膜分离液中T淋巴细胞一定重量粘膜组织中分离出来的T淋巴细胞也可以用免疫细胞化学进行定量和定性研究。下面介绍用间接免疫荧光技术研究IEL的大致过程：

（1）将手术取得的肠管纵形剪开，将上皮层与固有层分离。

（2）上皮层放在无镁离子、含100U青霉素和链霉素及0.2%叠氮纳的PB中清洗，无血液和其它杂质后用解剖剪将组织剪碎，用匀浆器磨碎或用超声粉碎或用胶原酶溶解上皮细胞。

（3）匀浆液通过脱脂棉、尼龙筛（只允许淋巴细胞滤过，除去粘液、碎屑和上皮细胞凝集块）或金属网（200目）获得淋巴细胞悬液。

（4）将硅化玻璃球高压消毒，冲洗和平衡后将悬浮液过柱，得到的细胞液直接计数。也可以用淋巴细胞分离液提取，用台盼蓝测定其活性，并加10%FCS-RPMI细胞培养液，淋巴细胞数应达5×106/ml。

（5）试管内加0.1ml细胞液后加OKT系列单抗0.1ml，同时用另一试管加0.1mlPBS作对照。混合液在4℃放置30～60min（也可以在冰箱过夜）后，PBS（含RPMI）冲洗3次，离心后细胞沉淀物再加PBS至0.1ml。

（6）加0.1mlFITC标记的抗鼠IgG（根据工作效价），4℃放置20～30min，PBS洗3次，离心后加在红细胞计数板上，荧光显微镜观察。

（7）阳性细胞为细胞膜上有绿色荧光，有的呈颗粒样，随细胞滚动。荧光镜下可计算200个淋巴细胞中阳性细胞所占的百分率，或根据血细胞计数板中阳性细胞算出细胞总数及百分率。